概述

原理

概述

核糖体展示技术(Ribosome Display Technology, RDT)是由Plückthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基础上改进而来的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术，它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核糖体上， 形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白的基因型和表型联系起来，可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等。运用此技术已成功筛选到一些与靶分子特异结合的高亲和力蛋白质， 包括抗体、 多肽、 酶等， 是蛋白质筛选的重要工具。

原理

核糖体展示技术通过聚合酶链反应 （PCR）扩增DNA文库，同时引入T7 启动子、核糖体结合位点及茎-环结构， 将其转录成 mRNA， 在无细胞翻译系统中进行翻译， 使目的基因的翻译产物展示在核糖体

表面， 形成 “mRNA-核糖体-蛋白质” 复合物， 构成核糖体展示的蛋白文库， 然后用相应的抗原从翻译混合物中进行筛选， 以乙二胺四乙酸 （EDTA） 解离结合的核糖体复合物或以特异抗原洗脱整个复合物，

并从中分离 mRNA。通过反转录聚合酶链反应（RT- PCR） 提供下一轮展示的模板， 所得 DNA进入下一轮富集，部分 DNA可通过克隆进行测序分析等。

Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库 中筛选多肽配体。在此之前 ， 利用前期多肽抗体进 行免疫沉淀 ， 已经分离到了与核糖体和多肽偶联的mRNA。 Mattheakis等人首次将前 人的设想付诸 实践，建立了筛选多肽类配体的多聚核糖体展示技术，并从一个库容为10^12的肽库中，筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固定化 单抗 的多肽 配 体。 Gersuk等人利用该技术也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外翻译时，蛋白或多肽的折叠与 翻译同步进行u。与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。这些研究结果说 明， 如果某种蛋 白质 的折叠不受核糖体蛋 白通道的影响， 那么与核糖体的 解离就不是该蛋 白获得天然构像的必要条件。1 9 9 7 年，Plückthun实 验 室 在 以上 研 究 成 果 的 基 础 上 ， 对 M a t t h e a k i s的多聚核糖体展示技术 进行 了改进， 建立了体外筛选完整功能蛋 白( 如抗体 ) 的新技术 ：核糖体展示技术。

核糖体展示 的基本过程如图1A所示。酋先构 建核糖体展示的 D N A模板 ， 然后依次体外转 录、 体外翻译和亲和筛选。转 录产物 mRNA( 翻译模板 ) 不含任何终止密码， 在体外翻译过程中核糖体会停 留在 mRNA的3''末端 ； 体外翻译和亲和筛选时， 始终保 持较高的镁离子浓度 ， 在冰上完成体外 翻译之后的

各步操作， 保证核糖体不会从 mRNA上解离,使筛选蛋白的基因型和表型以 m R NA一核糖体 一蛋白复合物的形式偶联在一起。洗脱缓冲液中含有 E D T A， 具有螯合镁离子 的作用。镁离子浓度降低后 ， 核糖体解 离 ， 释放 mR N A。后者经 过纯 化后 用作RT-PCR的模板 ， 重新引入核糖体展示的各种必需元件 ， 进行新 一轮的核糖体展示。当 mRNA与核糖体的比例接近 1 ： 1 时 ， 体外翻译产物中主要是单核糖体复合物 ，因此 ，Plückthun实验室将这一技术命名为核糖体展示技术。

R o b e r t s和 S z o s t a k 1 与 N e mo t o 1 分 别 独 立 设 计了另外一 种与核糖体 展示类似 的技术 ( 见图1B) 。 在 m R N A的 3 末端连入一个 嘌呤霉素标记 的 D N A 片段 ， 体外翻译时核糖体会停在 D N A与 R N A之间的连接处 ， 嘌呤霉素进入核糖体氨酰化位点， 并在肽酰转移酶的作用下与天然多肽偶联。多肽-嘌呤霉素-mR N A复合物与核糖体解离后， 直接用于亲和筛选。由于该技术采用共价偶联的方法将 mR N A与多肽连在一起 ， 因此被称为 R N A一多肽融合技术或体外病毒技术( i n v i t r o v i r u s ) 多肽-嘌呤霉素-mRNA复合物较 mRNA-核糖体-蛋白复合物更为 稳定 ， 实验证明 mR N A-核糖体-蛋 白复合物可以在4 ℃ 完整保 留 1 0天 左 右 ， 并 允 许 进 行剧 烈 的亲 和筛选 ， 足 以进 行功能蛋 白的筛选 。 (图1B见拓展阅读第一个网址，图1A网上没，传不了照片）

经过每轮核糖体展示 ， 筛选蛋 白一般能够被富集 1 0 0～1 0 0 0倍。采用核糖体展示技术从人源全 合成抗体库( 2×10^9 ) 中筛选到 的抗牛胰岛素 的单链抗体 ， 与建库 的原始抗体相 比， 亲和力提高 了 4 0倍以上 ， Kd值 达 8 2 p m o l u 引。 在 对 抗 酵 母 转 录 因 子G C N 4的鼠源特异性抗体库进行定 向进化时， 5轮筛选之后抗 体 的亲和力 提高 了 6 5倍 引。采用 易错P C R与 D N A s h u f f l i n g结合 的方式引入随机突变， 以核糖体展示作为筛选方式对已有单链抗体 的亲和力和稳定性进行定 向进化时 ， 抗体亲和力提高 3 0倍；还原条件下筛选到的不含二硫键桥 的单链抗体 ， 在 氧化环境 中恢复二硫键桥后 ， 稳定性 由 2 4 k J /m o l 提 高到 5 4 k J/m o l 。核糖体展示技术还被用于改造其 它蛋 白。C T L A 4是免疫 球蛋 白超 家族 的成员 ， 参与 T细胞活化 的信号传递过程。I r v i n g等人利用核糖体展示 技术对 C T L A 4的一 个结构域成 功进行 了亲和力成熟的体外进化。

核糖体展示 的整个过程完全在体外进行 ， 不经过转化 ， 可以进行大容量库 ( ≥1 0 “) 的构建与筛选,更有 利 于获得 具 有优 良性 状 的功 能蛋 白分 子 ； 避 免了体 内体外操作 的转换 ， 在短期内可以进行多轮筛选 ； 可 以方便 地运用 多种 体外突 变方 法 ， 如 寡 聚核苷酸定 点突 变 ， 易错 P C R， D N A s h u f f l i n g c 和 s t E p( s t a g — g e r e d e x t e n s i o n p r o c e s s ) ] ， 引入突变； 在洗脱过程 中，核糖体复合物解离， 而筛选蛋 白仍然与其配体结合在一起， 因此可以筛选到具有极高亲和力的蛋 白分子 ；通过调整筛选条件 ， 如添加竞争性抗原或延 长筛选时问， 还可以改善抗体的识别表位、 抗体稳定性以及其它分子性质； 核糖体展示 复合物在 4℃条件下 ， 可以放置几天以上， 允许体外翻译时或体外翻译之后增 加选 择 压 力 。可 以预测 ， 作 为具 有应 用 前 景的筛选工具， 核糖体展示技术将被广泛应用于功能蛋白或多肽的筛选和蛋白分子定向进化研究。

参考资料：

【1】王祥斌等,核糖体展示技术的原理与应用,中华微生物学与免疫学杂志，Vol 22,issue 5

【2】岳建华等，核糖体展示小分子抗体的研究进展，中国药物与临床，2006，4

【3】刘涛等，核糖体展示技术的研究进展，中国农业报，2009,21（9）