酵母双杂合系统最初是在人们对酵母转录因子GAL4的认识基础上的。一个完整的酵母转录因子GAL4可分为结构上可以分开的、功能上相互独立的两个结构域：位于N端1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域（DNA binding domain, DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(Activation domain, DAN-AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合。而AD则是通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录[2]。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在上较为接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。将DNA-BD与已知的诱饵蛋白质X融合，构建出BD-X质粒载体；将AD基因与cDNA文库，基因片段或基因突变体（以Y表示）融合，构建出AD-Y质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。该酵母菌株含有特定报告基因（如LacZ, HIS3, LEU2等），并已经支队相应转录因子的编码基因，因此本身无报告基因的转录活性。蛋白质X和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达（图1 ），使转化体由于HIS3或LEU2表达而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ表达而在X-Gal存在下显蓝色。通过筛选阳性菌落即可检测已知蛋白间的相互作用、蛋白质二聚体的形成、确定蛋白质相互作用的结构域或重要活性位点，以及从cDNA文库中筛选与已知蛋白质X相互作用的未知蛋白质Y的编码序列等。